Sybr Green I染料法操作过程

1实验方法囊腔组织经液氮速冻后，放入-70℃冰箱保存备用。Real-timePCR法检测EMMPRIN的mRNA含量。1.1组织总RNA提取：

（1）从液氮中取出组织，用已处理过的剪刀剪取约100mg组织块，加入1mlTrizol试剂，转移至匀浆器中，将匀浆器置于冰水上充分研磨，转移研磨好的匀浆液至无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，室温下静置5min。

（2）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀10次充分混匀，室温下静置2-5min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间10min；

（3）小心吸取上层水相溶液至另一无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，小心吸取上层水相，勿碰及或吸走中间层，否则要重新离心再吸取（可吸取约0.4-0.5ml）。

（4）加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温下静止15min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间15min。小心弃上清，沿管壁加入1ml75%乙醇（DEPC水配置,预冷），室温下静置1min，4℃状态下离心，速度7500r/min，离心时间5min；小心倒掉上清，再4℃状态下离心，速度3500r/min，时间离心1min；离心后用10μl枪头小心吸去残余液体，最后用30μlDEPC-H2O溶解RNA。

（5）提取的总RNA经紫外分光光度计测定，提取物浓度OD260/280比值在1.8-2.0之间。1.2逆转录反应：用上述细胞中提取的2μg总RNA在下述20μl反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下：5×RT-Buffer4μl,oligd(T)2.5μmol/L,dNTPs5mmol/L,RNA酶抑制剂（RNAsin)20U。首先70C预变性5min，然后加入逆转录酶MMLV200U，再于42C孵育1h，72C加热10min灭活逆转录酶。1.3Real-timePCR反应：1.3.1方法学确认根据引物相关信息PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并且对其纯化，假设纯化所得DNA浓度为a×10x，对其做10倍梯度稀释7次，稀释浓度依次为a×10x-

1、a×10x-

2、a×10x-

3、a×10x-

4、a×10x-

5、a×10x-

6、a×10x-7选择合适稀释品作为标准品模板。1.3.2取上述逆转录反应产物于20μl反应体系中进行PCR反应。PCR引物由上海之江生物科技有限公司合成。表1PCR中所用引物序列PrimerSequence(5′to3′)Length（bp）GAPDHForwardprimer5-GTCGGTGTGAACGGATTT-3276GAPDHReverseprimer5-ACTCCACGACGTACTCAGC-3EMMPRINForwardprimer5’-TGGCCTTCACGTTCCTGAGT-3’215EMMPRINReverseprimer5’-GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’反应体系组成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP10mmol/L(0.4μl)、MgCl225mmol/L(1.6μl)、5UTaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl、上、下游特异引物各0.25μl、去离子水16.2μl。按下述热循环参数运行：GAPDH内参照基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火56×15s，延伸72×15S（采光）共30个循环。EMMPRIN基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火58×15s，延伸72×12s（采光）共35个循环。以SLAN软件分析并计算目的基因EMMPRIN与GAPDH的Ct值。2实验结果2.1内参照基因、目的基因琼脂糖凝胶电泳结果：随机选择3份标本PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在理论片段大小位置有单一条带且无杂带和引物二聚体。结果见图：图1：GAPDH电泳图图2：EMMPRIN电泳图2.2试剂扩增效率验证：经过对标准品定量，内参照基因GAPDH扩增检测Ct值与浓度对数值的相关系数为0.99996，目的基因EMMPRIN扩增检测Ct值与浓度对数值的相关系数为0.99969。内参照基因和目的基因皆有良好的扩增效率（相关系数0.98）。可用ΔCt法行数据统计。结果见图：图三：GAPDH定量标准曲线图四：GAPDH定量标准曲线荧光曲线图五：EMMPRIN定量标准曲线图六：EMMPRIN定量标准曲线荧光曲线